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告别ChIP-的折磨-CUT&Tag技术详解

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编者按:新方法和新技术的革命经常带来科学研究的巨大变化。最近出现的CUT& Tag将复杂的ChIP-Seq转变为方便简单的操作,为研究DNA-蛋白质相互作用提供了有效的工具。

不久前,Fred Hutchinson癌症研究中心的Henikoff博士发表了有关自然通信中CUT& Tag技术的详细结果和实验方案。与以前的方法如ChIP-Seq和pA-MNase相比,CUT&Tag技术方法简便易行,信噪比高,重复性好,需要的细胞数量少至60个细胞,且有望将ChIP-Seq做到单细胞水平再次证明了创新技术方法的潜力。早在2018年5月,中国本土公司近岸蛋白质(NOVOPROTEIN)便公开了该方法替代ChIP-Seq的可能性与核心原料ChiTagTM酶(一种Protein A与Tn5融合蛋白)的技术原理(图1),表明中国生物技术公司已经走出了对外国公司的简单模仿,而且某些领域的自主创新能力处于世界前列。 Henikoff博士的文章进一步证明了ChiTag(Chromatin Immuno-Tagment)酶在解决蛋白质-DNA相互作用方面的巨大潜力。

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图1. CUT& Tag原理示意图。

CUT&Tag是什么,它将带来哪些影响?

CUT& Tag是蛋白质-DNA相互作用研究的新方法。与传统的ChIP-Seq相比,它具有以下优点:节省时间和效率,需要更少的细胞体积,低背景信号,良好的重复性等。可用于单细胞水平测序。 CUT& Tag有望将蛋白质和染色质DNA之间的相互作用转化为类似于PCR的常规操作,并彻底改变了基因调控和表观遗传学领域的研究。

在生物学研究中,DNA-蛋白质相互作用(DPI)至关重要。基因表达,调控,复制,重组和修复,RNA转运,翻译和调节均无DPI,几乎所有生命活动都涉及DPI。早在十九世纪末期,科学家通过显微镜观察了蛋白质与DNA的直接相互作用。从那时起,他们开始探索蛋白质结合和控制DNA的机制。为了研究DPI,科学家们发明了许多方法:凝胶阻滞,DNaseI足迹测试,甲基化干扰,体内足迹,酵母单杂交,ChIP-Seq等。其中,ChIP-Seq由于能真实、完整地反映结合在DNA序列上的靶蛋白,是目前全基因组水平研究DPI的标准实验技术。

ChIP-Seq的基本过程包括:通过甲醛交联将DNA结合蛋白固定在细胞中,裂解细胞,并超声切割DNA;将DNA-蛋白质复合物与特异性抗体结合,并使用可以将抗体与抗体结合的ProteinA磁珠 - 抓取蛋白质-DNA复合物,然后将DNA与蛋白质解离;填充DNA片段,加入A,加入接头,最后进行高通量测序。由于在ChIP-Seq实验过程中甲醛交联,染色质断裂,共免疫沉淀和文库构建的步骤繁琐且难以控制,常规ChIP-Seq实验需要大量细胞,且实验重复性差、信噪比低。细胞长期经过长时间的硬化培养是浪费的很难分析。数据再次进行了实验,获得了大量不同的无意义数据,即使是熟练的博士也只花了不到半年的时间。这些技术难题限制了ChIP-Seq在DPI研究中的进一步应用,阻碍了表观基因组等领域的发展。

【0x9A9A】【0x9A9A】:在抗体的引导下,几丁质酶只对局部组蛋白修饰标记物、转录因子或染色质调节蛋白结合染色质中感兴趣的DNA进行碎片化,同时添加测序连接物并将其释放到细胞中。外部。由于大多数不相关的染色质保留在细胞核内,整个实验CUT&Tag技术的基本原理。该方法是单管高通量应用,可与单细胞测序平台“无缝”结合。

切割标记与Chip Seq过程进行比较:

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图2.比较Cut&tag、Cut&Run和Chip Seq结果:Cut&tag具有更好的信噪比和更低的背景。(见文献)

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图3.左面板:cut&tag、cut&run、chip seq三种分析h3k4me1组蛋白修饰的方法:cut&tag在识别染色质特征方面最有效,可以提供chip seq无法读取的信息;右面板:峰值调用比较,使用默认参数调用每种方法的峰值,结果表明cut&tag比cut&run、chip seq或atac seq具有更高的信号。(见文献)

更重要的是,信噪比大幅提高,同时简化了实验步骤。由于在pcr之前的反应是在细胞内进行的,Henikoff博士通过将单个细胞分配到5184nm孔中,然后添加随机标记的引物进行扩增来实现单细胞测序(图4)。

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图4. CUT和标签单细胞测序过程(见文献)

ChiTag酶在打断基因组的同时加上接头,不需要繁琐的补平加A加接头,在一天内可以完成从细胞到测序文库制备全流程。CUT&Tag能够对极少量细胞(60个细胞)甚至单细胞进行分析

ConA磁珠颗粒可以通过低速离心代替。低速离心是指以600×g离心3分钟,快速离心是指以<100×g离心3秒。

附:

1)在室温下收集EP管中的新鲜细胞并计数;低速离心以除去溶液;

2)通过向管中加入细胞穿孔缓冲液重悬细胞;低速离心以除去溶液;

3)将细胞穿孔缓冲液加入试管中,重悬细胞,轻轻摇动,加入重悬于结合缓冲液中的ConA磁珠,轻轻混匀,混合5-10分钟;

CUT&Tag 实验操作流程

1)快速离心EP管,离心管盖液,将EP管放在磁力架上沉淀细胞并除去溶液。

2)将预先冷却的抗体缓冲液加入EP管中重悬细胞,轻轻摇动并置于冰上;

3)向每个管中加入0.5-1μl一抗(制造商推荐的抗体),轻轻涡旋;

4)在室温下将EP管在振荡器上孵育2小时;

1. 细胞预处理(0.5-1h)

1)快速离心EP管,离心管盖液体,将EP管置于磁力架中以沉淀细胞并除去溶液。

2)在穿孔缓冲液中稀释第二抗体1: 100,加入试管中,轻轻摇动;

3)在室温下将EP管在振荡器上孵育30-60分钟;

4)快速离心细胞,离心管帽液体,将EP管放在磁性框架上沉淀细胞并除去溶液。

5)向管中加入0.8-1ml穿孔缓冲液并翻转10次;

6)重复步骤4)和5)两次。

2. 一抗结合目的蛋白(2h)

1)快速离心EP管,离心管盖液体,将EP管置于磁力架中以沉淀细胞并除去溶液。

2)在穿孔缓冲液2中稀释ChiTag转座体1: 250并将其加入细胞中,轻轻摇动;

3)在室温下将EP管在振荡器上孵育1小时;

4)快速离心细胞,离心管帽液体,将EP管置于磁架中以沉淀细胞并除去溶液。

5)向管中加入0.8-1ml穿孔缓冲液2并翻转10次;

6)重复步骤4)和5)两次。

3. 二抗结合一抗(1h)

1)快速离心EP管,离心管盖液体,将EP管置于磁力架中以沉淀细胞并除去溶液。

2)向管中加入300μlChiTagActivation Buffer并轻轻摇动;

3)在37℃孵育1小时。

4. ChiTag转座体结合抗体(1.5h)

5. 激活ChiTag转座体,片段化目的DNA(1h)

6. DNA提取(1h)

7. PCR(1h),PCR之前需加入72C,5min步骤

8. DNA纯化(30min)

NOVOPROTEIN成立于2004年,是一家专注于蛋白质技术创新和应用的高科技企业。主要研究人员分别来自杜克大学,康奈尔大学,德克萨斯大学,复旦大学,华中科技大学等着名大学。该公司拥有创新的技术平台,如重组蛋白,大容量抗体库,晶体结构和分子进化。累计研制出13,000多种重组蛋白,包括560种药物靶蛋白,50多种NGS和分子诊断酶,200多种诊断抗体抗原,2000多种器官和细胞培养因子等科研试剂。它为300多家抗体药物公司以及国内外数以千计的研究机构和诊断试剂公司提供高质量的蛋白质支持。这些产品已被数千篇SCI论文引用。

地址:上海市浦东新区张江高科技园区伽利略路11号1号楼

参考文献:Hatice S. Kaya-Okur,Steven J. Wu,Christine A. Codomo,Erica S. Pledger,Terri D. Bryson,Jorja G. Henikoff,Kami Ahmad&amp;史蒂文亨尼科夫。 CUT&amp; Tag用于小样本和单细胞的有效表观基因组分析。自然通讯。 2019,10(1): 1930。

9. 上机测序

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